遺傳發育所作物基因組單堿基編輯方法研究取得進展

如何快速高效進行突變體檢測和鑒定是植物基因組編輯技術迅速發展面臨的重要問題之一。目前植物基因組編輯突變檢測方法主要包括PCR/RE、T7EI錯配切割、臨界退火溫度PCR (ACT-PCR)、Sanger測序和二代測序(NGS)等。以上所有的檢測方法都基于PCR反應，且都有各自的不足之處。PCR/RE方法的需要設計含有限制性內切酶位點的靶位點；T7EI無法區分純合突變體和野生型以及雜合突變體與雙等位突變體；ACT-PCR對PCR反應條件要求極高，而且無法檢測到雜合突變；Sanger測序和NGS的價格比較昂貴，尤其是對于數目比較大的群體。

針對上述問題，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組利用CRISPR/Cas系統(包括Cas9和Cpf1)的體外切割特性，在六倍體小麥和二倍體水稻中建立了一種簡單、高效、廉價的PCR/RNP植物突變體篩選策略。該方法不受限制性內切酶位點的限制，比PCR/RE具有更強的廣適性；比T7EI具有更高的準確度；比Sanger測序更廉價，而且靈敏度更高。基于SpCas9和FnCpf1 RNPs的PCR/RNP方法可以用于檢測基因組編輯中經NHEJ修復產生的所有indel突變；基于FnCpf1 RNPs的PCR/RNP方法可以用于檢測位于種子區域(seed region)內的SNP突變。該方法尤其適用于小麥的瞬時表達基因組編輯體系，如該實驗室之前建立的CRISPR/Cas9 IVTs和RNPs介導的DNA-free基因組編輯體系。這是由于瞬時表達基因組編輯體系在后續組織培養過程中不使用任何的篩選標記，在T0代會獲得較多的待篩選植株，而且PCR/RNP方法可以使用通用引物對發生在小麥A組、B組和D組各拷貝的突變進行同時檢測，不會受靶位點周圍SNPs的影響。此外，PCR/RNP方法也可以用于檢測TALEN蛋白所誘導的突變。

該研究成果于5月3日在線發表于Plant Biotechnology Journal 雜志上(DOI: 10.1111/pbi.12938)。高彩霞研究組博士生梁振為該論文的第一作者。相關研究得到科技部、北京市科委、中科院以及國家自然基金委的資助。